Effets de la 5G - Relais Co., Ltd

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8305 (2023) Citer cet article

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Les risques potentiels pour la santé de l'exposition aux champs électromagnétiques radiofréquences des technologies de communication mobile ont soulevé des préoccupations sociétales. Des directives ont été établies pour protéger la population (par exemple, un échauffement non spécifique supérieur à 1 °C lors d'une exposition à des champs de radiofréquence), mais des questions subsistent concernant les effets biologiques potentiels d'expositions non thermiques. Avec l'avènement de la cinquième génération (5G) de communication mobile, évaluer si l'exposition à ce nouveau signal induit une réponse au stress cellulaire est l'une des étapes obligatoires de la feuille de route pour un déploiement sûr et l'évaluation des risques pour la santé. À l'aide de la technique BRET (Bioluminescence Resonance Energy-Transfer), nous avons évalué si l'exposition continue ou intermittente (5 min ON / 10 min OFF) de kératinocytes et de fibroblastes humains vivants aux signaux 5G 3,5 GHz à un taux d'absorption spécifique (SAR) jusqu'à 4 W/kg pendant 24 h a un impact sur l'activité basale ou chimiquement induite du facteur de choc thermique (HSF), du virus du sarcome RAt (RAS) et des kinases régulées par le signal extracellulaire (ERK) et de la protéine de la leucémie promyélocytaire (PML), qui sont toutes moléculaires voies impliquées dans les réponses environnementales au stress cellulaire. Les principaux résultats sont (i), une diminution du signal BRET basal de HSF1 lorsque les cellules fibroblastes ont été exposées aux DAS les plus faibles testés (0,25 et 1 W/kg), mais pas au plus élevé (4 W/kg), et ( ii) une légère diminution de l'efficacité maximale d'As2O3 pour déclencher la SUMOylation de la PML lorsque les cellules fibroblastes, mais pas les kératinocytes, étaient continuellement exposées au signal RF-EMF 5G. Néanmoins, étant donné l'incohérence de ces effets en termes de type de cellule impactée, de DAS efficace, de mode d'exposition et de réponse au stress cellulaire moléculaire, nous avons conclu que notre étude ne montre aucune preuve concluante que des effets moléculaires peuvent survenir lorsque les cellules de la peau sont exposées au RF 5G. -EMF seul ou avec un facteur de stress chimique.

Dans le cadre du déploiement rapide des télécommunications mobiles au cours des dernières décennies, la 5e génération (5G) de réseaux sans fil a été conçue pour améliorer la technologie 4G LTE en résolvant les problèmes liés à l'augmentation exponentielle de l'utilisation, au nombre d'appareils connectés et au besoin de une plus grande fiabilité et une latence plus faible1,2. De telles réalisations ont nécessité de nouvelles bandes de fréquences en plus de celles déjà déployées pour la 2G, la 3G et la 4G. Parmi elles, la bande 3,4-3,8 GHz offre un bon compromis entre couverture haut débit et débit, tandis que la bande 26 GHz, caractérisée par une propagation et une pénétration médiocres à l'intérieur des bâtiments, sera déployée dans un deuxième temps pour couvrir des zones limitées à forte densité de données. circulation. Par conséquent, la bande 3,5 GHz (également connue sous le nom de bande C), qui peut utiliser les mêmes sites cellulaires que les antennes mobiles actuelles de 2,6 GHz et 1,8 GHz, est la bande centrale de la 5G actuelle.

Les effets biologiques et sanitaires de l'exposition aux champs électromagnétiques radiofréquences environnementaux (RF-EMF) ont fait l'objet de nombreuses études depuis la fin du XXe siècle, et sont toujours au centre des préoccupations sociétales. Ce domaine de recherche a également été renforcé par la décision du Centre international de recherche sur le cancer (CIRC) en mai 2011 de classer les RF-EMF comme cancérogènes 2B.

Notamment, alors que l'énergie des photons RF n'est pas assez forte pour déclencher des modifications chimiques dans des cibles biologiques, telles que des ruptures d'ADN, le chauffage diélectrique des tissus vivants sous exposition RF-EMF est entièrement caractérisé. Des lignes directrices ont donc été établies pour protéger la population contre les risques associés3. Cependant, la question de savoir si l'exposition aux RF-EMF peut déclencher des effets "non thermiques" (c'est-à-dire des effets biologiques non causés par l'élévation de la température dans les tissus vivants) reste une question difficile à étudier. Puisqu'il n'y a pas de support mécaniste pour ces effets, la communauté scientifique ne peut s'appuyer que sur des recherches empiriques concernant les effets non thermiques potentiels RF-EMF4,5,6.

Malheureusement, très peu de données issues d'études scientifiques sont disponibles sur le danger biologique potentiel présenté par l'exposition RF-EMF aux nouveaux signaux de fréquence utilisés dans la 5G. À notre connaissance, seuls six articles, réalisés par quatre équipes différentes, ont déjà été publiés qui ont exploré les effets des RF-EMF 3,5 GHz non modulés ou modulés par GSM sur la matière vivante, mais aucune étude biologique n'a depuis été publiée avec la 5G. -signaux RF-EMF 3,5 GHz modulés. Dasgupta et al. ont exposé des poissons zèbres en développement à des champs électromagnétiques RF non modulés de 3,5 GHz à un taux d'absorption spécifique (SAR) de 8,27 W/kg pendant 6 à 48 h après la fécondation dans des conditions de culture isothermes7,8. Ces auteurs ont mesuré des effets sensori-moteurs subtils mais persistants et une perturbation transcriptomique modeste à 48 h après la fécondation, avec 28 gènes exprimés de manière différentielle dans les groupes exposés. Il reste à déterminer si ces effets sont toujours mesurables à l'aide de niveaux de DAS conformes aux lignes directrices. Wang et al. ont évalué l'impact des expositions à court et à long terme à l'aide de champs électromagnétiques RF de 3,5 GHz non modulés à trois DAS différents (2,6, 26 et 260 mW/kg) sur Drosophila melanogaster9,10. Ces auteurs ont montré un impact modéré mais significatif sur l'activité, le sommeil et le développement des insectes qui s'accompagnait d'une modification de l'expression de gènes impliqués dans les rythmes circadiens, le stress thermique, le stress oxydatif et l'immunité humorale. Yang et al. ont évalué l'effet d'une exposition non modulée aux RF-EMF de 3,5 GHz avec un DAS de 0, 2, 4 ou 10 W/kg pendant 72 h sur le comportement de type anxieux et le cortex auditif (ACx) chez les cobayes. Cette étude a mis en évidence une augmentation SAR-dépendante du stress oxydatif, de l'induction de l'apoptose et des dommages ultrastructuraux chez les ACx sans augmentation des seuils d'anxiété et d'audition des animaux11. Enfin, Bektas et al. ont évalué si le signal de 3,5 GHz modulé par GSM induisait une modification de l'homéostasie énergétique et de l'équilibre redox dans le cerveau de rats diabétiques et en bonne santé exposés pendant 2 ha par jour pendant 30 jours à un DAS calculé de 0,323 W/kg dans le cerveau12. Après exposition aux RF-EMF, chez les rats diabétiques et en bonne santé, une diminution des niveaux totaux d'antioxydants et une augmentation des niveaux totaux d'oxydants et de H2O2 ont été observées dans les tissus cérébraux. Ces auteurs ont également observé que les RF-EMF provoquaient la variation des niveaux d'hormones qui influencent la prise alimentaire et le métabolisme énergétique dans le cerveau et augmentaient le nombre de neurones dégénérés dans l'hippocampe. Au total, ces études suggèrent un effet potentiel des RF-EMF de 3,5 GHz sur plusieurs voies de réponse au stress chez les organismes eucaryotes.

Évaluer si les nouvelles technologies RF-EMF induisent une réponse au stress cellulaire dans des conditions d'exposition bien contrôlées est donc l'une des étapes obligatoires de la feuille de route pour l'évaluation des risques pour la santé des signaux 5G. En particulier, au niveau moléculaire, la question de savoir si l'expression des protéines de choc thermique (HSP) et les voies de transduction du signal RAS/MAPK sont induites a été fortement débattue en raison du rôle central joué par ces systèmes moléculaires dans les réponses au stress des cellules13,14. Des questions subsistent également concernant l'apparition d'un stress oxydatif dans les cellules exposées aux RF-EMF15. Par conséquent, il est crucial d'évaluer plus avant l'effet des signaux RF nouvellement déployés, tels que le signal 5G, sur les mécanismes moléculaires génériques impliqués dans la réponse au stress cellulaire. Dans la présente étude, nous avons étudié l'effet d'un signal RF-EMF de 3,5 GHz modulé en 5G sur le facteur de choc thermique basal et induit chimiquement 1 (HSF1), le virus du sarcome RAt (RAS) et les kinases régulées par le signal extracellulaire (ERK) kinases et les activités de la leucémie promyélocytaire (PML).

HSF1 est le "maître régulateur" de la transcription des protéines de choc thermique chez les eucaryotes16. Les kinases RAS et ERK sont des éléments clés des cascades de protéines kinases activées par les mitogènes Ser/Thr (MAPK) qui relaient les signaux extracellulaires vers les processus intracellulaires après l'activation de RAS17,18. La voie de signalisation RAS/MAPK est essentielle dans la régulation de divers processus cellulaires tels que l'expression des gènes, la croissance cellulaire et la survie. Enfin, la protéine PML est la clé de voûte de la formation des corps nucléaires PML (PML NBs). Ce sont des domaines nucléaires sphériques qui se forment en réponse à diverses conditions de stress, y compris le stress oxydatif, et qui sont d'une importance primordiale pour l'apoptose, la sénescence, la réparation de l'ADN, le contrôle épigénétique, ainsi que le contrôle de l'oncogenèse19. La formation de PML NBs est donc un marqueur des réponses cellulaires au stress et est également importante pour l'activité de nombreux facteurs de transcription et protéines nucléaires, dont HSF1 et ERK20,21,22,23,24. Notre étude a utilisé des fibroblastes et des kératinocytes de la peau humaine comme modèles cellulaires, car les cellules de la peau deviendront le principal tissu cible de l'exposition à la 5G à prendre en compte pour l'évaluation des risques25. Ces cellules ont été exposées en continu ou par intermittence (5 min ON/10 min OFF) au signal RF-EMF 3,5 GHz modulé en 5G à 0,25, 1 et 4 W/kg dans des conditions isothermes pendant 24 h avant HSF1, RAS, ERK, et les activités PML ont été évaluées, grâce à des sondes moléculaires à base de transfert d'énergie par résonance de bioluminescence (BRET)13,14,26.

Les capteurs RAS et ERK BRET ont été développés en remplaçant le donneur d'énergie fluorescente (ECFP ou Turquoise-GL) et l'accepteur d'énergie fluorescente (YPet-M) des sondes EKAREV et RaichuEV-ras FRET27 par la nanoLuciférase (nLuc28) et le mNeonGreen (mNeonG29), respectivement. Le vecteur d'expression de mammifère codant les sondes FRET ERK (pEKAREV) et RAS (pRaichuEV-Ras) a été gracieusement fourni par le Dr Matsuda M (Université de Kyoto, Japon). Les ADNc codant pour nLuc et mNeonG ont d'abord été synthétisés (Genescript, Rijswijk, Pays-Bas) puis clonés à la place du donneur d'énergie fluorescente, entre NotI et XbaI, dans les vecteurs d'expression pEKAREV et pRaichuEV-Ras.

L'ADNc codant pour les protéines nLuc-HSF1 et mNeonG-HSF1 a été dérivé des vecteurs d'expression rLuc-HSF1 et sYFP2-HSF113, dans lesquels les groupes Renilla Luciférase II et sYFP2 ont été remplacés par nLuc et mNeonG, respectivement, entre BamHI et EcoRI. Le vecteur d'expression HSP90 a également été décrit dans Poque et al.13.

De même, l'ADNc codant pour les protéines nLuc-PMLIII et mNeonG-SUMO1 a été dérivé des vecteurs d'expression rLuc-PMLIII et YFP-SUMO1, dans lesquels Renilla Luciférase et YFP ont été remplacés par nLuc et mNeonG, respectivement, entre BamHI et EcoRI.

As2O3 (A1010, solution mère 330 mM remise en suspension dans du NaOH 1 N) et MG132 (C2211, Z-Leu-Leu-Leu-al, solution mère 50 mM remise en suspension dans du DMSO) provenaient de Sigma (Lyon, France). Le phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA) a été acquis auprès de Tocris (Bristol, Royaume-Uni) et la coelenterazine H auprès de Nanolight Technology (Pinetop, AZ, États-Unis).

Nous avons utilisé la lignée de fibroblastes cutanés immortalisés SV-40 établie à partir d'une femme de 19 ans atteinte de xeroderma pigmentosum (XP), groupe de complémentation D, la lignée XP6BE30 fournie par le Coriell Institute (Camden, NJ). Les fibroblastes XP6BE ont été maintenus dans le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco - haut glucose (DMEM) (D6429, Sigma) complété avec 10% de sérum bovin fœtal, 100 unités mL-1 de pénicilline et de streptomycine. Les kératinocytes HaCaT31 ont été maintenus dans du Keratinocyte-SFM (Ref 17005-034; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) additionné d'extrait pituitaire bovin (BPE; Numéro de catalogue 13028-014, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) & Human Recombinant EGF (numéro de catalogue 10450-13, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) fourni avec le kit Gibco™ Keratinocyte-SFM Supplement (Réf 37000015, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Vingt-quatre heures avant la transfection, les cellules ont été ensemencées à une densité de 500 000 cellules par puits dans des boîtes à 6 puits. Des transfections transitoires ont été réalisées à l'aide de polyéthylèneimine (PEI, linéaire, MW 25 000; numéro de catalogue 23966 Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA) avec un rapport PEI: ADN de 4: 1, comme décrit précédemment32. Pour la mesure de l'activité HSF1, 0,1 µg de vecteur d'expression nLuc-HSF1 a été co-transfecté avec 1,4 µg de mNeonG-HSF1 et 0,5 µg de vecteurs d'expression HSP90. Pour la mesure des activités RAS et ERK, 1 µg de vecteurs d'expression pEKAREV ou pRaichuEV-Ras BRET ont été co-transfectés avec 1 µg de vecteur vide. Pour la mesure de l'activité PML, 0,1 µg de vecteur d'expression nLuc-PMLIII a été co-transfecté avec 1,9 µg de mNeonG-SUMO1. Après une nuit d'incubation, les cellules transfectées ont ensuite été détachées, remises en suspension dans du DMEM sans phénol rouge (Réf 21063-029, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) et replaquées à une densité de 105 cellules par puits dans des plaques blanches à 96 puits avec fonds transparents (Greiner Bio one, Courtaboeuf, France) prétraités à la d-polylysine (Sigma, Lyon, France) pour lecture au luminomètre Tristar2 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Allemagne) ou sur lamelles de verre de 12 mm de diamètre (Knittel Glass , Braunschweig, Germany) traité avec de la d-polylysine pour la lecture avec le spectromètre SpectraPro 2300i (Acton Optics, Acton, MA, USA) (voir ci-dessous). Les cellules ont été laissées en culture pendant 24 h avant d'être traitées pour le test BRET.

Les cellules ont été exposées de manière fictive pendant 24 h (c'est-à-dire que les cellules ont été cultivées en l'absence de RF-EMF) ou exposées aux conditions d'exposition RF-EMF indiquées pendant 24 h. Au cours des dernières 18 h, 4 h ou 15 min d'exposition fictive ou RF, les cellules ont été incubées avec la concentration indiquée de MG132, As2O3 ou PMA respectivement (Fig. 1A). Un seul produit chimique a été testé dans chaque plaque à 96 puits ; Cependant, diverses concentrations du même composé chimique ont été testées simultanément dans une seule plaque en injectant des solutions mères 10X préchauffées à 37 ° C à l'aide d'une pipette multicanaux. Lorsque cela était indiqué, des simulations de traitement ont été effectuées en injectant uniquement l'agent solvatant dans le milieu de culture cellulaire (DMSO pour MG132 et PMA ou eau pour As2O3). Pour effectuer le traitement chimique, les plaques ont été retirées de la chambre réverbérante (voir ci-dessous "Cellules exposition, configuration de l'exposition et dosimétrie "de la section Matériel et méthodes) et immédiatement amarré sur un réchauffeur Peltier pour microplaque Thermostat Plus (Eppendorf, Hambourg, Allemagne) pour maintenir les cellules à 37 °C. Les plaques exposées de manière fictive ont été traitées de la même manière. Le retrait de la plaque de la chambre réverbérante, l'envoi des produits chimiques aux différentes concentrations dans les milieux de culture cellulaire à l'aide d'une pipette multicanaux et le remplacement des cellules dans la chambre réverbérante ont pris moins de 1 min. Après l'achèvement de l'exposition RF restante, 5 µM de coelenterazine H ont été ajoutés au milieu de culture cellulaire et le signal BRET a été immédiatement acquis à l'aide d'un lecteur de microplaques TriStar2 LB942 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Allemagne) préchauffé à 37 °C et équipé avec des filtres d'émission centrés à 515 ± 20 nm pour mNeonG (Iacceptor) et 460 ± 20 nm pour nLuc (Idonor). Alternativement, pour la mesure BRET en temps réel sous exposition RF-EMF, 5 µM de coelenterazine H ont été ajoutés au milieu de culture cellulaire 10 min avant la fin de l'exposition RF-EMF et les spectres BRET complets ont été enregistrés à distance pendant les 5 dernières minutes de Exposition RF-EMF et les 5 minutes suivantes en l'absence de RF-EMF. Les spectres BRET complets ont été acquis à l'aide d'une fibre optique reliée à un spectrographe d'imagerie IsoPlane SCT-320 équipé d'un système de caméra CCD rétro-éclairé BLAZE: 400B pour l'enregistrement du spectre visible complet (Teledyne France - Princeton Instruments, Lisses, France).

(A) Chronologie de l'exposition RF-EMF et addition de médicaments chimiques dans le milieu de culture cellulaire. Le RF-EMF (ou exposition RF simulée) est appliqué pendant 24 h quel que soit le médicament considéré, c'est-à-dire injecté pendant la durée indiquée. (B,C) Variation de température dans les plaques exposées à un signal RF-EMF continu (B) ou intermittent (C) modulé 5G de 3,5 GHz à 4W/kg. La température dans l'incubateur a été réglée pour assurer une exposition cellulaire à 37 ° C et pour compenser l'augmentation de température induite par les RF EMF au début de la période d'exposition. L'injection de drogue induit une baisse transitoire inférieure à 0,5 ° C de la température de la culture cellulaire (B).

Le signal BRET a été déterminé en calculant le rapport de l'intensité d'émission mesurée dans la fenêtre accepteur (ImNeonG) sur l'intensité d'émission mesurée dans la fenêtre donneuse (InLuc), selon l'Eq. (1)

En raison du chevauchement des spectres d'émission de nLuc et de mNeonG, une fraction de la lumière détectée dans le filtre mNeonG provient de l'émission de la luciférase, ce qui entraîne un signal contaminant33. Dans cette configuration, le BRET net a donc été défini comme le rapport BRET des cellules co-exprimant les constructions nLuc et mNeonG moins le rapport BRET des cellules exprimant uniquement la construction nLuc dans la même expérience.

Le logiciel GraphPad Prism v8.00 pour Mac (GraphPad Software, La Jolla, Californie, États-Unis) a été utilisé pour tracer les courbes dose-réponse et effectuer des analyses statistiques. La taille des barres d'erreur indique le SD dans l'ensemble de données. Les courbes dose-réponse sigmoïdales ont été ajustées à l'aide de l'équation. (2):

où X est le logarithme de la concentration d'agoniste et Y la réponse ; Bottom est la valeur Y au niveau du plateau inférieur et est prise comme la mesure du niveau basal d'activation des diverses sondes ; Top est la valeur Y au niveau du plateau supérieur et Top-Bottom est pris comme la mesure de l'efficacité maximale d'un traitement chimique donné sur chaque sonde BRET ; Log EC50 est la valeur X lorsque la réponse est à mi-chemin entre Bas et Haut (Supp. Fig. 1). La valeur EC50 représente donc une mesure de la puissance apparente des divers composés chimiques pour déclencher l'activation de leur sonde BRET apparentée (Supp. Fig. 1). Les puissances des produits chimiques pour activer ou inhiber les différentes sondes sont exprimées en pEC50 ± SEM (erreur standard de la moyenne), c'est-à-dire égale à -log EC50.

Le test de rang signé de Wilcoxon à un échantillon a été utilisé pour évaluer la signification statistique par rapport à l'hypothèse nulle des différences calculées dans chaque expérience indépendante entre les conditions d'exposition fictives (pas de condition RF EMF) et RF-EMF pour le BRET basal, les puissances et les efficacités des produits chimiques. (ci-après dénommées ΔBasal BRET, ΔpEC50 et ΔMax efficacité, respectivement). Le nombre total d'expériences indépendantes (n) réalisées pour chaque condition expérimentale est indiqué. Une exposition fictive a été effectuée pour chaque condition d'exposition RF-EMF. Les valeurs de p inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

Les cellules ont été exposées pendant 24 h dans des plaques de culture tissulaire à 96 puits (TCP) à des niveaux de DAS de 0,25, 1 et 4 W/kg. L'exposition intermittente (5 min ON/10 min OFF) au même niveau moyen de DAS qu'avec le mode d'onde continue (CW) a été mise en œuvre pour imiter l'exposition réelle réelle et aider à détecter les effets biologiques non thermiques potentiels. Des expositions fictives aux CEM RF ont également été réalisées dans des conditions expérimentales identiques mais avec le générateur éteint, c'est-à-dire à un DAS égal à 0 W/kg. Un nouveau système d'exposition, récemment conçu et caractérisé, a été utilisé pour la première fois pour des expositions de cellules à des signaux 3,5 GHz modulés en 5G34. Le système était basé sur un incubateur de culture cellulaire qui permettait de maintenir les conditions biologiques souhaitées de 37 °C et 5 % de CO2. La caractérisation complète du système, par des mesures expérimentales et des simulations numériques a été décrite en détail ailleurs34. Brièvement, un incubateur de 150 l (BINDER Gmbh, Tullingen, Allemagne), constitué de parois en acier inoxydable, a été utilisé comme chambre de réverbération, c'est-à-dire une grande cavité métallique fermée, avec un facteur Q élevé, où un flux statistiquement homogène, une distribution de champ polarisée de manière aléatoire et isotrope a été obtenue par agitation mécanique des composants de champ35. Un signal électromagnétique à 3,5 GHz a été délivré aux échantillons biologiques via une antenne patch imprimée. Un support en plastique à cinq niveaux a été utilisé pour accueillir et exposer simultanément dix TCP de 6 ou 96 puits, soit deux par niveau de support. Chaque puits des TCP à 6 et 96 puits a été rempli avec 2 ml et 200 µl de milieu de culture cellulaire, respectivement. Pour assurer la reproductibilité expérimentale pendant l'exposition, l'incubateur a été chargé avec la même configuration utilisée pour la caractérisation électromagnétique, c'est-à-dire quatre et six TCP de 6 et 96 puits, respectivement, en raison de la forte dépendance du SAR à la charge de la chambre.

L'unité de génération de signal, composée d'un générateur de signal RF (SMBV100A, Rohde & Schwarz, Munich, Allemagne), d'un amplificateur à gain de 45 dB (Mini-circuits, ZHL-16W-43+, NY, USA), d'un circulateur de puissance ( Pasternack, PE83CR1005, CA, USA), et un coupleur bidirectionnel (Mini-circuits, ZGBDC30-372HP+, NY, USA), était situé à l'extérieur de l'incubateur. De plus, pour assurer la surveillance continue de la puissance d'entrée souhaitée dans la chambre, les puissances incidente et réfléchie ont été surveillées avec un wattmètre (Agilent N1912A, USA) connecté au coupleur bidirectionnel.

Le SAR local a été récupéré expérimentalement grâce à des mesures de température du chauffage induit par RF-EMF enregistrées avec une sonde à fibre optique (Luxtron One, Lumasense Technologies, CA, USA). Le DAS mesuré dans le TCP à 96 puits était d'environ 1 W/kg par watt de puissance d'entrée d'antenne. Pour valider nos systèmes, des simulations numériques ont été réalisées à l'aide de la méthodologie électromagnétique basée sur le domaine temporel des différences finies (FDTD)36. Les résultats des simulations ont été moyennés sur 50 positions de l'agitateur, correspondant à une rotation complète. Bien que les simulations numériques ne garantissent pas l'absence de points chauds à des endroits spécifiques des puits exposés, l'agitation continue des composants du champ via la rotation mécanique de l'agitateur métallique a assuré l'obtention d'une bonne homogénéité SAR avec une variation de 30 %. Dans l'ensemble, nous avons montré que les DAS expérimentaux et numériques étaient en bon accord avec des différences < 30 % compte tenu de l'écart-type conforme aux directives de l'ICNIRP3. Selon les valeurs mesurées et simulées normalisées à 1 W, la puissance incidente lors de l'exposition biologique a été ajustée pour obtenir les niveaux d'exposition requis de 0,25, 1 et 4 W/kg dans une plaque de culture tissulaire à 96 puits. Des mesures de l'élévation de température induite du milieu exposé ont également été réalisées à l'aide de la sonde Luxtron (Lumasense) dans la condition d'exposition cellulaire spécifique de l'étude, montrant une augmentation de température de 1,7 °C à 4 W/kg, 0,7 °C à 1 W /kg et une augmentation de température négligeable en dessous de 0,1 °C à 0,25 W/kg en utilisant une exposition RF continue, et une augmentation de température de 0,8 °C à 4 W/kg, 0,3 °C à 1 W/kg et moins de 0,1 °C à 0,25 W/kg en utilisant une exposition RF intermittente (5 min ON, 10 min OFF). La température de l'incubateur a été diminuée en conséquence pour maintenir les échantillons biologiques à 37°C. La stabilité de la température des cultures cellulaires au fond des puits de culture pendant toutes les sessions RF aux différents niveaux de SAR a été soigneusement évaluée dans un ensemble de plaques séparées (voir Fig. 1B, C pour les traces de température typiques obtenues à 4 W/kg en continu et conditions d'exposition intermittente, respectivement). Comme prévu, la température de la culture cellulaire exposée au signal intermittent est légèrement ondulée (Fig. 1C). Il convient de noter que l'injection du produit chimique a déclenché une chute transitoire de la température de la culture cellulaire de moins de 0,5 ° C, comme illustré à la Fig. 1B.

L'hypothèse selon laquelle les RF-EMF de 3,5 GHz modulés par la 5G peuvent avoir un impact sur l'activité basale ou chimiquement induite par HSF1, RAS, ERK ou PML a été testée à l'aide de tests basés sur le BRET précédemment décrits par notre équipe13,14,26. BRET est un test cellulaire pour étudier les interactions protéine-protéine et les changements de conformation des protéines dans les cellules en temps réel et vivantes. Cette technique repose sur le transfert d'énergie de résonance Forster d'un donneur bioluminescent à un accepteur fluorescent, tous deux fusionnés aux protéines d'intérêt. Dans notre conception expérimentale, les sondes BRET ont été exprimées dans des cellules vivantes. Étant donné que les lignées cellulaires de fibroblastes et de kératinocytes utilisées dans cette étude sont plus difficiles à transfecter que les cellules HEK293T utilisées dans nos études précédentes, nous avons systématiquement remplacé la protéine rLuc2 dans nos tests BRET par la nanoLuciférase (nLuc) plus brillante28. Nous avons également remplacé l'accepteur fluorescent sYFP2 par mNeonGreen (mNeonG) dans tous nos tests en raison du plus grand chevauchement entre les spectres d'émission nLuc et les spectres d'excitation mNeonG37.

Pour surveiller l'activité de HSF1, nous avons précédemment conçu un test BRET intermoléculaire permettant le suivi de la trimérisation de HSF113, un événement clé sur la feuille de route de l'activation de HSF1 en réponse à des conditions de stress telles que le stress thermique, le stress oxydatif ou le stress protéotoxique38. Dans cet essai, HSF1 marqué par nLuc N-terminal est co-exprimé avec HSF1 marqué par mNeonG dans une lignée cellulaire donnée. Étant donné que HSF1 se trimérise lors de l'activation, le signal BRET résultant augmente après l'activation de HSF1 puisque la trimérisation rapproche les groupes donneur et accepteur13 (Fig. 2A).

Effet de l'exposition continue ou intermittente au signal 5G sur l'activation de HSF1 dans les fibroblastes XP6BE. (A) Mode d'action du test intermoléculaire HSF1 BRET. (B) Courbes dose-réponse des changements induits par MG132 dans le signal nLuc-HSF1/mNeonG-HSF1 BRET. Les cellules de fibroblastes XP6BE co-exprimant de manière transitoire les protéines nLuc-HSF1 et mNeonG-HSF1 ont été activées pendant 18 h à 37 ° C avec une concentration croissante de MG132 avant la mesure du BRET. Les résultats représentent la moyenne ± SEM de 10 expériences indépendantes réalisées en double. La pEC50 du MG132 était de 6,83 ± 0,25 tandis que l'efficacité maximale du MG132 était de 0,106 ± 0,018. (C–E) Des fibroblastes cutanés XP6BE transfectés avec la sonde BRET nLuc-HSF1/mNeonG-HSF1 ont été exposés de manière fictive ou exposés à 3,5 GHz modulés par la 5G à 0,25, 1 ou 4 W/kg pendant 24 h, soit en continu, soit par intermittence (5 min MARCHE/10 min ARRÊT). Les cellules ont été activées en utilisant des concentrations croissantes de MG132 sous exposition fictive ou RF-EMF pendant les 18 dernières heures de la période d'exposition RF-EMF avant que la mesure BRET ne soit effectuée. Les résultats dans les panneaux CE représentent les diagrammes Box et Whisker de la variation basale du BRET (C), de la variation de la puissance du MG132 (D) et de la variation de l'efficacité maximale du MG132 (E) entre le 5G RF-EMF exposé- (Expo) et conditions factices en mode d'exposition continu et intermittent (marche/arrêt). La signification statistique de la dérivation de l'hypothèse nulle (pas de différence entre l'exposition factice et l'exposition aux RF-EMF) a été évaluée à l'aide du test de rang signé de Wilcoxon à un échantillon. n = 6–12 selon les conditions expérimentales. ns non significatif ; *p < 0,05 ; **p < 0,01.

Pour évaluer la fonctionnalité de ce test dans les fibroblastes cutanés, nous avons co-exprimé nLuc-HSF1 avec mNeonG-HSF1 dans la lignée cellulaire de fibroblastes XP6BE39 et provoqué les cellules transfectées avec des concentrations croissantes de l'inhibiteur de protéasome MG132 pour déclencher un stress protéotoxique40. Comme prévu, MG132 a induit une augmentation dépendante de la concentration du signal BRET basal avec une CE50 dans la gamme des cent nanomolaires (Fig. 2B), montrant l'efficacité du test.

Nous avons ensuite évalué si l'exposition cellulaire continue ou intermittente (5 min ON/10 min OFF) au signal RF-EMF modulé 5G de 3,5 GHz à 0,25, 1 et 4 W/kg dans des conditions isothermes pendant 24 h avait un impact sur le nLuc-HSF1/ Signal BRET basal mNeonG-HSF1, ou la puissance ou l'efficacité de MG132 pour activer HSF1 dans la lignée cellulaire de fibroblastes XP6BE transfectée. Fait intéressant, nous avons mesuré une diminution peu importante mais significative et reproductible du BRET basal HSF1 lorsque la lignée cellulaire de fibroblastes XP6BE était exposée en continu à 0,25 W/kg pendant 24 h ou exposée par intermittence à 0,25 et 1 W/kg pendant 24 h (Fig. 2C) . Alors que cette diminution du signal BRET ne représente que ~ 6 à 10% du BRET basal mesuré, elle correspond proportionnellement à ~ 37 à 61% (en valeur absolue) de l'effet déclenché par MG132 (Tableaux 1 et 2). Aucun effet n'a été mesuré à 4 W/kg que le signal soit émis en continu ou par intermittence. De plus, l'exposition au signal RF-EMF n'a modifié ni la puissance du MG132 ni son efficacité à activer HSF1, quels que soient le DAS et le mode d'émission continu ou intermittent du signal (Fig. 2D, E, Tableaux 3 et 4).

Pour évaluer l'impact potentiel des expositions RF-EMF 3,5 GHz modulées en 5G sur l'activité RAS basale ou induite chimiquement, des cellules de fibroblastes XP6BE ont été transfectées avec une sonde BRET consistant à prendre en sandwich le H-Ras et le domaine Ras-Binding de Raf ( Raf RBD) entre nLuc et mNeonGreen. Cette sonde moléculaire BRET est dérivée de la sonde Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)- décrite par le laboratoire Matsuda27,41, et repose sur le rapprochement de nLuc et mNeonG suite à la liaison de GTP-Ras à Raf RBD (Fig. 3A).

Effet de l'exposition continue ou intermittente aux RF-EMF 5G sur l'activation du RAS dans les fibroblastes cutanés XP6BE. (A) Mode d'action du biocapteur RAS BRET. (B) Courbes dose-réponse du changement induit par le PMA dans l'activité RAS à l'aide de la sonde pRaichuEV-Ras BRET. Les fibroblastes XP6BE ont été activés pendant 15 min à 37 ° C avec une concentration croissante de PMA avant la mesure du BRET. Les résultats représentent la moyenne ± SEM de 10 expériences indépendantes réalisées en double. La pEC50 du PMA était de 7,60 ± 0,17 tandis que l'efficacité maximale du PMA était de 0,107 ± 0,012. (C – E) Les cellules de fibroblastes XP6BE transfectées avec la sonde pRaichuEV-Ras BRET ont été exposées de façon fictive ou exposées à 3,5 GHz modulé par la 5G à 0,25, 1 ou 4 W/kg pendant 24 h, soit en continu, soit par intermittence (5 min ON/ 10 min OFF). Les cellules ont été activées en utilisant des concentrations croissantes de PMA sous exposition fictive ou RF-EMF pendant les 15 derniers mètres avant que la mesure BRET ne soit effectuée. Les résultats dans les panneaux CE représentent les diagrammes Box et Whisker de la variation basale du BRET (C), de la variation de la puissance du PMA (D) et de la variation de l'efficacité maximale du PMA (E) entre le 5G RF-EMF exposé- (Expo) et conditions factices en mode d'exposition continue ou intermittente. La signification statistique de la dérivation de l'hypothèse nulle (pas de différence entre l'exposition factice et l'exposition aux RF-EMF) a été évaluée à l'aide du test de rang signé de Wilcoxon à un échantillon. n = 6–12 selon les conditions expérimentales. ns non significatif ; *p < 0,05 ; **p < 0,01.

De même, l'impact potentiel de l'exposition au signal RF-EMF de 3, 5 GHz modulé en 5G sur l'activité ERK basale ou induite chimiquement a été évalué dans des cellules de fibroblastes XP6BE transfectées avec une sonde BRET comprenant un domaine de capteur ERK et un domaine de ligand ERK reliés par un flexible lieur, mais pris en sandwich par un mNeonG et un nLuc au lieu de deux accepteur et donneur d'énergie fluorescente comme initialement décrit 27 (Fig. 4A). Une fois activées, les protéines ERK endogènes phosphorylent la partie capteur de cette sonde BRET. Ceci déclenche l'interaction du domaine capteur avec le domaine ligand, induisant ainsi la fermeture du biocapteur sur lui-même. Un tel changement de conformation rapproche nLuc de mNeonGreen, augmentant ainsi l'efficacité du BRET.

Effet de l'exposition continue ou intermittente aux RF-EMF 5G sur l'activation de l'ERK dans les fibroblastes cutanés XP6BE. (A) Mode d'action du biocapteur ERK BRET. (B) Courbes dose-réponse du changement induit par le PMA dans l'activité ERK à l'aide de la sonde pEKAREV BRET. Les fibroblastes XP6BE ont été activés pendant 15 min à 37 ° C avec une concentration croissante de PMA avant la mesure du BRET. Les résultats représentent la moyenne ± SEM de 10 expériences indépendantes réalisées en double. La pEC50 du PMA était de 7,72 ± 0,15 tandis que l'efficacité maximale du PMA était de 0,178 ± 0,018. (C – E) Les cellules de fibroblastes XP6BE transfectées avec la sonde pEKAREV BRET ont été exposées de manière fictive ou exposées à 3,5 GHz modulé par la 5G à 0,25, 1 ou 4 W/kg pendant 24 h, soit en continu, soit par intermittence (5 min ON/10 min DÉSACTIVÉ). Les cellules ont été activées en utilisant des concentrations croissantes de PMA sous exposition fictive ou RF-EMF pendant les 15 derniers mètres avant que la mesure BRET ne soit effectuée. Les résultats dans les panneaux CE représentent les diagrammes Box et Whisker de la variation basale du BRET (C), de la variation de la puissance du PMA (D) et de la variation de l'efficacité maximale du PMA (E) entre le 5G RF-EMF exposé- (Expo) et conditions factices en mode d'exposition continue ou intermittente. La signification statistique de la dérivation de l'hypothèse nulle (pas de différence entre l'exposition factice et l'exposition aux RF-EMF) a été évaluée à l'aide du test de rang signé de Wilcoxon à un échantillon. n = 6–12 selon les conditions expérimentales. ns non significatif ; *p < 0,05 ; **p < 0,01.

Les fibroblastes XP6BE exprimant de manière transitoire ces sondes BRET sensibles au RAS et à l'ERK ont donc été provoqués pendant 15 min avec du phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA), un phorbol-ester bien connu imitant le diacylglycérol conduisant à l'activation du RAS dépendante de la PKC et ERK42. Comme prévu, le PMA a induit une augmentation concentration-dépendante du BRET mesuré avec les sondes BRET RAS (Fig. 3B) et ERK (Fig. 4B). De plus, pour les deux sondes BRET, la CE50 mesurée était de l'ordre de dizaines de nanomolaires, démontrant à nouveau la haute sensibilité de nos tests basés sur BRET pour surveiller l'activation de RAS et ERK.

L'exposition continue ou intermittente de fibroblastes XP6BE exprimant de manière transitoire les sondes RAS et ERK au signal RF-EMF de 3,5 GHz modulé en 5G pendant 24 h n'a pas eu d'impact sur le BRET basal RAS et ERK (Figs. 3C et 4C, Tableaux 1 et 2) ni sur la puissance PMA ( Figs. 3D et 4D, Tableau 3) ou efficacité maximale (Figs. 3E ou 4E, Tableau 4) pour activer ces kinases. Nous n'avons mesuré qu'une légère diminution de la puissance du PMA pour activer ERK dans les fibroblastes XP6BE exposés en continu pendant 24 h à un DAS de 0, 25 W / kg (Fig. 4D, Tableau 3).

Enfin, sachant que l'addition covalente post-traductionnelle de SUMO à PML, un processus connu sous le nom de SUMOylation, est un événement clé conduisant à l'activation de PML et à la formation de NB de PML, nous avons utilisé un test BRET intermoléculaire26 pour évaluer si la 5G- continue ou intermittente l'exposition au signal RF-EMF modulé de 3,5 GHz peut affecter l'activité PML. Dans cet essai, nous avons mesuré le signal BRET entre une protéine SUMO1 marquée en N-terminal avec mNeonGreen et une protéine PMLIII marquée en C-terminal avec nLuc (Fig. 5A). Les fibroblastes XP6BE transfectés de manière transitoire avec les vecteurs d'expression PMLIII-nLuc/mNeonG-SUMO1 ont donc été provoqués avec du trioxyde d'arsenic (As2O3), un inducteur de stress oxydatif bien connu dans les cellules43 qui déclenche efficacement la SUMOylation de PML26,44. Comme prévu, As2O3 a augmenté de manière dose-dépendante le signal BRET entre PMLIII-nLuc et mNeonG-SUMO1 dans les cellules de fibroblastes XP6BE avec une CE50 dans la gamme des dizaines de nanomolaires (Fig. 5B), indiquant une SUMOylation PML efficace dans ces cellules. De plus, ni la SUMOylation basale de la PML ni la puissance de l'As2O3 ni l'efficacité maximale pour déclencher la SUMOylation de la PML n'ont été affectées après une exposition intermittente de fibroblastes XP6BE transfectés de manière transitoire au signal RF-EMF de 3, 5 GHz modulé en 5G pendant 24 h, quel que soit le DAS testé (Fig. 5C – E ). Cependant, nous avons mesuré une diminution légère mais reproductive de la SUMOylation basale de la PML lorsque les fibroblastes XP6BE ont été exposés en continu pendant 24 h à 4 W / kg (Fig. 5C). Cette variation représentait moins de 3,5 % du signal BRET basal de la PML (Tableau 1) et 14,9 % de l'efficacité maximale de l'As2O3 (en termes absolus) (Tableau 2). De plus, une exposition continue pendant 24 h n'a pas modifié la puissance d'As2O3 pour déclencher la SUMOylation de PML (Fig. 5D, Tableau 3), mais a entraîné une légère diminution de l'efficacité maximale d'As2O3 par rapport à la condition (Fig. 5E, Tableau 4).

Effet de l'exposition continue ou intermittente au 5G-EMF sur la SUMOylation de la PML dans les fibroblastes cutanés XP6BE. (A) Description schématique des tests BRET intermoléculaires pour la détection de PML SUMOylation. (B) Courbes dose-réponse de la SUMOylation de PML induite par As2O3 à l'aide du dosage intermoléculaire PML-nLuc/mNeonGreen-SUMO1. Les fibroblastes XP6BE ont été activés pendant 4 h à 37 ° C avec une concentration croissante d'As2O3 avant la mesure du BRET. Les résultats représentent la moyenne ± SEM de 10 expériences indépendantes réalisées en double. La pEC50 d'As2O3 était de 7,19 ± 0,15 tandis que l'efficacité maximale du PMA était de 0,161 ± 0,014. (C – E) Les fibroblastes XP6BE co-transfectés avec le vecteur d'expression mammifère codant pour PML-nLuc et mNeonGreen-SUMO1 ont été exposés de manière fictive ou exposés à 5G modulé à 3,5 GHz à 0,25, 1 ou 4 W/kg pendant 24 h, soit en continu, soit par intermittence (5 min ON/10 min OFF). Les cellules ont été activées en utilisant des concentrations croissantes d'As2O3 sous une exposition fictive ou RF-EMF pendant les 4 dernières heures avant que la mesure BRET ne soit effectuée. Les résultats dans les panneaux CE représentent les diagrammes Box et Whisker de la variation basale du BRET (C), de la variation de la puissance As2O3 (D) et de la variation de l'efficacité maximale As2O3 (E) entre le 5G RF-EMF exposé- (Expo) et conditions factices en mode d'exposition continue ou intermittente. La signification statistique de la dérivation de l'hypothèse nulle (pas de différence entre l'exposition factice et l'exposition aux RF-EMF) a été évaluée à l'aide du test de rang signé de Wilcoxon à un échantillon. n = 6–12 selon les conditions expérimentales. ns non significatif ; *p < 0,05 ; **p < 0,01.

Nous avons ensuite évalué si nous n'avions pas manqué un effet potentiel de l'exposition aux RF qui aurait pu disparaître pendant les courts laps de temps entre la fin de l'exposition et la fin de la lecture du BRET (moins de 5 min). Pour vérifier cette hypothèse, de la coelentérazine H a été ajoutée aux puits de culture cellulaire pour démarrer la réaction bioluminescente 10 min avant la fin de l'exposition des cellules au signal 3,5 GHz modulé par la 5G émis en continu à 4 W/kg. Ensuite, à l'aide d'une fibre optique, nous avons mesuré à distance le rapport BRET en temps réel pendant les 5 dernières minutes de la période d'exposition RF-EMF de 24 h et avons continué à mesurer pendant les 5 minutes suivantes sans exposition RF. Comme indiqué sur la Fig. 6, quelle que soit la sonde BRET considérée, et en présence ou non d'activation chimique, nous n'avons détecté aucune variation du signal BRET après la fin de l'exposition RF, validant ainsi les résultats précédemment obtenus.

Surveillance en temps réel de la variation du BRET après l'arrêt RF-EMF. Les cellules HEK293T qui ont été transfectées avec les sondes HSF1 (A), RAS (B), ERK (C) ou PML (D) BRET ont été exposées à une fréquence de 3,5 GHz modulée en 5G à 4 W/kg pendant 24 h et soit traité ou traité avec 1 µM de PMA, 10 µM d'As2O3 ou 10 µM de MG132 selon le calendrier indiqué sur la Fig. 1A. La coelenterazine H a été injectée dans le milieu de culture cellulaire 10 min avant la fin de l'exposition RF-EMF. Les signaux BRET ont été mesurés à distance pendant les 5 dernières minutes avant la fin de l'exposition RF-EMF et pendant les 5 minutes suivantes après la fin de l'exposition RF-EMF. Pour chaque sonde BRET, la cinétique de l'évolution du signal BRET est montrée dans une cellule traitée par simulation et traitée par un médicament, et représente la moyenne de 3 à 4 expériences indépendantes.

Dans un effort supplémentaire pour étudier l'effet potentiel du signal 5G sur les cellules de la peau et étant donné que la couche supérieure de la peau (épiderme) est principalement composée de kératinocytes, nous avons effectué une nouvelle série d'expériences en utilisant la lignée cellulaire de kératinocytes HaCaT pour évaluer si un Une exposition continue de 24 h aux RF-EMF 3,5 GHz modulées en 5G peut avoir un impact sur les activités HSF1, RAS, ERK et PML. Les cellules HaCaT transfectées de manière transitoire avec les sondes BRET sondant HSF1, RAS, ERK et PMLIII ont été respectivement provoquées avec une concentration croissante de MG132 (pour HSF1), PMA (pour RAS et ERK) et As2O3 (pour PML) après un traitement fictif ou continu. exposition à des RF-EMF de 3,5 GHz modulés en 5G pendant 24 h à trois SAR différents de 0,25, 1 et 4 W/kg. Des courbes dose-réponse ont été générées pour chaque condition expérimentale (voir Supp. Fig. 2 pour les courbes dérivées de la condition d'exposition fictive). Le BRET basal de chaque sonde et la puissance et l'efficacité maximale de chaque agent chimique ont donc été calculés, et la variation de chaque paramètre entre les conditions d'exposition factice et d'exposition RF-EMF a été rapportée à la Fig. 7. Nous n'avons trouvé aucune différence entre les conditions d'exposition factice et exposée. conditions, quelle que soit la cible moléculaire, le DAS ou la métrique considérée. La seule exception était une légère augmentation de l'efficacité maximale du PMA pour activer ERK lorsque les cellules HaCaT étaient exposées à 1 W/kg.

Effet de l'exposition continue ou intermittente aux RF-EMF 5G sur les activités HSF1, ERK, RAS et PML dans les kératinocytes HaCaT. Les cellules de kératinocytes HaCaT exprimant de manière transitoire les constructions HSF1, ERK, RAS et PML ont été exposées de manière fictive ou exposées à 3,5 GHz modulé par la 5G à 0,25, 1 ou 4 W/kg pendant 24 h, soit en continu, soit par intermittence (5 min ON/10 min OFF ). Les cellules ont été activées en utilisant des concentrations croissantes de MG132 (HSF1), PMA (RAS et ERK) ou As2O3 (PML) sous exposition simulée ou RF-EMF au cours des dernières 18 h (HSF1), 15 min (RAS et ERK) ou 4 h (PML) de la période d'exposition RF-EMF. L'exposition RF-EMF a ensuite été arrêtée et les signaux BRET ont été mesurés immédiatement. Pour chaque courbe dose-réponse, le signal BRET basal, la puissance et l'efficacité maximale de l'agent chimique activateur ont été dérivés et rapportés sous forme de boîtes et de diagrammes à moustaches de la variation entre les conditions d'exposition RF-EMF 5G (Expo) et fictives en continu ou mode d'exposition intermittente. La signification statistique de la dérivation de l'hypothèse nulle (pas de différence entre l'exposition factice et l'exposition aux RF-EMF) a été évaluée à l'aide du test de rang signé de Wilcoxon à un échantillon. n = 6–13 selon les conditions expérimentales. ns non significatif ; *p < 0,05 ; **p < 0,01.

Dans cette étude, nous avons examiné si l'exposition continue ou intermittente (5 min ON / 10 min OFF) au signal RF-EMF modulé en 5G de 3,5 GHz à 0,25, 1 et 4 W/kg pendant 24 h dans des conditions isothermes avait un impact sur les fibroblastes cutanés humains. et la réponse au stress des cellules kératinocytes au niveau moléculaire. En utilisant nos propres sondes moléculaires existantes à base de BRET, nous nous sommes concentrés sur les protéines HSF1, RAS/ERK et PML qui sont au carrefour de diverses voies moléculaires, assurant une réponse cellulaire appropriée à un large éventail de stress environnementaux, y compris les lésions thermiques, le stress oxydatif , et le stress protéotoxique38. Nous avons évalué si l'exposition au signal 5G affectait l'activité basale ou activée chimiquement pour chacun de ces marqueurs moléculaires de stress cellulaire.

Nous avons constaté que le niveau basal de BRET HSF1 était réduit lorsque les cellules de fibroblastes XP6BE étaient respectivement exposées à un signal 5G continu et intermittent pendant 24 h à 0, 25 W / kg et à un signal 5G intermittent pendant 24 h à 1 W / kg. Aucun changement dans le signal BRET basal de HSF1 n'a été détecté à 1 W/kg lorsqu'un signal continu était utilisé ou lorsque les cellules étaient exposées en continu ou par intermittence à 4 W/kg.

À première vue, la diminution induite par RF-EMF du signal BRET basal HSF1 peut sembler relativement faible puisqu'elle ne représente que 6 à 11% du signal BRET basal HSF1 dans l'expérience fictive (Fig. 2B). Cependant, étant donné que l'activation chimique avec MG132 n'a augmenté le BRET basal que de 0, 1 unité BRET (soit une augmentation de 14% du BRET basal) (Fig. 2B), l'effet de l'exposition RF-EMF 5G semble important en termes de valeurs absolues. Fait intéressant, ces résultats sont parallèles à ceux que nous avons précédemment obtenus avec des cellules HEK293T exposées pendant 24 h à un signal 1,8 GHz non modulé (onde continue, CW) ou modulé par GSM13. Dans cet ancien travail, l'exposition aux RF-EMF a légèrement diminué l'activité basale de HSF1 au SAR inférieur testé (1,5 W/kg) mais pas au SAR supérieur (4 W/kg). Il reste à déterminer si l'effet de RF-EMF sur HSF1 basal peut avoir un impact sur la réponse au stress physiologique dépendante de HSF1 chez les organismes exposés à RF-EMF. Dans cette précédente étude in vitro, alors que nous avions détecté que l'efficacité maximale du MG132 pour déclencher la trimérisation de HSF1 dans les cellules HEK293T était augmentée après une exposition de 24 h aux signaux CW ou GSM à 1,5 W/kg et au signal CW à 6 W/kg13, nous avons ne détectent aucune variation de la puissance ou de l'efficacité du MG132 pour déclencher l'activation de HSF1 après une exposition aux RF-EMF 5G (Fig. 2).

Considérant les autres tests BRET effectués sur des fibroblastes cutanés, nous n'avons détecté qu'un léger décalage vers la gauche, moins d'un quart de log, de la puissance du PMA pour activer ERK à 0,25 W/kg et une petite réduction de l'efficacité de l'As2O3 pour déclencher la SUMOylation de la PML, mais uniquement lorsque les cellules sont continuellement exposées. Aucun autre effet induit par les RF n'a pu être détecté sur les fibroblastes exposés aux RF-EMF 5G, quelle que soit la sonde moléculaire considérée et quel que soit le SAR ou l'enveloppe de signal utilisée. Enfin, dans tous les tests effectués sur les kératinocytes, nous n'avons détecté qu'une augmentation d'environ 37 % de l'efficacité du PMA pour activer ERK à 1 W/kg mais pas à 0,25 ou 4 W/kg. Il est important de noter qu'aucun changement dans la mesure du BRET n'a été détecté après la fin de l'exposition RF-EMF lorsque le signal BRET a été lu en temps réel dans des cellules de fibroblastes qui ont été exposées en continu pendant 24 h au 5G modulé 3,5 GHz à 4 W/kg, statuant -out un biais potentiel dû au temps nécessaire pour lire notre signal BRET dans des plaques à 96 puits après la fin de l'exposition RF-EMF.

Au total, ces résultats peuvent paraître déroutants à plusieurs niveaux. Compte tenu des types de cellules utilisés, il est remarquable que l'exposition RF-EMF avec deux ondes porteuses différentes (1,8 et 3,5 GHz) et avec une modulation de signal différente (modulation CW ou GSM dans notre étude précédente et modulation 5G dans la présente étude) peut diminuent systématiquement l'activité basale de HSF1 dans les cellules rénales embryonnaires HEK293T13 et les fibroblastes cutanés XP6BE (Fig. 2), mais pas dans les kératinocytes HaCaT (Fig. 7). De même, nous avons détecté que l'efficacité maximale du PMA pour activer ERK (i) diminuait lorsque les cellules HEK293T étaient exposées à un signal CW ou modulé par GSM à 1,8 GHz, (ii) augmentait dans les kératinocytes, mais (iii) n'était pas impactée en 5G RF- Fibroblastes cutanés exposés aux CEM. Enfin, l'efficacité maximale de l'As2O3 pour déclencher la SUMOylation de la PML était légèrement diminuée dans les fibroblastes cutanés lorsqu'il était exposé en continu mais n'était pas modifiée dans les kératinocytes.

Plusieurs auteurs ont déjà rapporté des variations qualitatives ou quantitatives de certains effets biomoléculaires induits dans différentes lignées cellulaires suite à leur exposition à des signaux RF-EMF dans la gamme GHz dans des conditions expérimentales identiques45,46,47. Bien que l'on s'attende à ce que différents types de cellules puissent répondre différemment au même stimulus, à notre connaissance, aucune équipe de recherche n'a encore élucidé pourquoi et comment les RF-EMF de bas niveau peuvent avoir un impact sur la matière vivante. Outre l'absence de mécanismes non thermiques, il est également intrigant que les quelques effets induits par RF-EMF détectés ici sur les activités HSF1, ERK et PML ne suivent pas un profil dose-réponse classique. Par exemple, l'inhibition induite par RF-EMF de l'activité basale du HSF dans les fibroblastes cutanés humains n'a pu être détectée qu'à 0,25 W/kg mais pas à 4 W/kg, sous des expositions intermittentes et continues. De manière frappante, à 1 W/kg, il n'y avait aucun changement dans le BRET basal HSF1 lorsque les cellules étaient exposées en continu, tandis que le BRET basal HSF1 était encore diminué lorsque les cellules étaient exposées par intermittence. De même, l'efficacité maximale du PMA pour activer ERK dans les kératinocytes a été augmentée à 1 W/kg mais ni à 0,25 W/kg ni à 4 W/kg (Fig. 5). Seule l'efficacité maximale de l'As2O3 pour déclencher la SUMOylation de la PML semblait diminuer de manière dose-dépendante avec le SAR sous exposition continue, mais l'ampleur de cet effet était faible (tableau 4).

L'exposition aux RF-EMF à de faibles niveaux peut-elle provoquer un effet biologique non thermique alors que l'exposition aux RF-EMF à des niveaux plus élevés ne le peut pas ? Plusieurs auteurs dans ce domaine de recherche ont déjà signalé l'effet dit "de fenêtre", où l'exposition aux CEM à des intensités spécifiques produit un effet biologique donné qui ne pourrait pas être détecté en utilisant l'exposition aux CEM à des intensités inférieures ou supérieures48,49. Malheureusement, aucune autre preuve expérimentale n'a été publiée ultérieurement concernant un tel effet de fenêtre et, par conséquent, aucune explication concernant le mécanisme moléculaire sous-jacent n'a été fournie par les auteurs.

Plus récemment, Pooam et al. ont invoqué un effet hormétique dose-réponse pour expliquer que la production de ROS dans les cellules HEK293T exposées à 1,8 GHz RF-EMF est maximale à une amplitude de signal intermédiaire50. L'hormèse est un concept toxicologique caractérisé par une réponse biologique stimulée lorsqu'elle est exposée à une faible quantité subtoxique de stresseur et par les effets néfastes de niveaux élevés et toxiques du même stresseur51. En outre, il a été démontré qu'un éventail impressionnant de mécanismes moléculaires cytoprotecteurs et de voies de transduction du signal répondent de manière hormétique, y compris l'activation de HSF1 et ERK52,53. Par conséquent, si l'exposition RF-EMF, seule ou en combinaison avec un agent d'activation chimique, pourrait déclencher ou amplifier une réponse hormétique sur l'activité HSF1 ou ERK doit être étudiée plus attentivement. Fait intéressant, l'hormèse est également un processus dépendant du temps54. Il convient de noter qu'un effet hormétique dépendant du temps a été proposé pour expliquer qu'une courte exposition (1 h) à 1,8 GHz RF-EMF à un DAS moyen de 4,0 W/kg induit une fragmentation de l'ADN dans les fibroblastes embryonnaires de souris tandis qu'une exposition plus prolongée (36 h ) a réduit la fragmentation de l'ADN à un niveau inférieur à celui de la condition factice55. En conséquence, puisque nous n'avons testé qu'un seul temps d'exposition (24 h), il sera intéressant de répéter ces expériences pour évaluer la variation potentielle en fonction du temps des effets détectés ici.

En conclusion, notre étude BRET ne montre aucune preuve concluante que des effets moléculaires peuvent survenir lorsque les cellules de la peau sont exposées à un signal RF-EMF 5G (3,5 GHz) pendant 24 h, même à des niveaux supérieurs aux directives de l'ICNIRP pour l'exposition du public aux champs lointains (0,08 W/Kg). Seuls quelques changements statistiquement significatifs ont été détectés qui dépendent (i) de la sonde moléculaire utilisée, (ii) du type de cellules utilisées, (iii) de la présence d'un agent chimique activateur, avec un temps et une dose plus que probables. dépendance, et (iv) les caractéristiques de l'exposition RF-EMF telles que le DAS, la fréquence ou la modulation de l'onde porteuse. Étant donné que nous avons utilisé plus de 100 paramètres expérimentaux différents et que tous les effets détectés sauf un présentaient un risque d'erreur de 5 %, on s'attendait statistiquement à ce qu'il y ait des données faussement positives. Nous sommes parvenus à une conclusion similaire lorsque nous avons étudié l'effet de divers signaux de 1,8 GHz sur des cultures de cellules cérébrales primaires et des lignées cellulaires de neuroblastome à l'aide de techniques sans étiquette56. Par conséquent, mis à part l'effet du RF-EMF sur l'activité basale de HSF1 qui pourrait mériter d'autres investigations, nous n'avons trouvé aucune preuve suffisante de l'effet physiologique du RF-EMF testé seul ou en combinaison avec des produits chimiques.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nous remercions Bernard Veyret pour ses conseils avisés et sa relecture du manuscrit.

Les recherches ayant abouti à ces résultats ont bénéficié d'un financement de l'Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail (Anses) dans le cadre de la convention de subvention EST-19 RF-18 (projet 5G-SAMU) et du conseil régional de Nouvelle-Aquitaine dans le cadre de la subvention accord AAPR2020A- 2019-8140010 (Le projet PHYSTRIG).

Université de Bordeaux, CNRS, laboratoire IMS, UMR5218, F-33400, Talence, France

Alexandre Joushomme, Lorenza Patrignoni, Anne Canovi, Yann Loïck Chappe, Florence Poulletier De Gannes, Annabelle Hurtier, André Garenne, Isabelle Lagroye & Yann Percherancier

Université de Limoges, CNRS, XLIM, UMR 7252, F-87000, Limoges, France

Rosa Orlacchio, Philippe Lévêque & Delia Arnaud-Cormos

Institut Universitaire de France (IUF), F-75005, Paris, France

Délia Arnaud-Cormos

Université de recherche Paris Sciences et Lettres, F-75006, Paris, France

Isabelle Lagroye

Université de Bordeaux, INSERM, Laboratoire BMGIC, UMR1035, F-33000, Bordeaux, France

François Moisan & Muriel Cario

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YP a conçu et conçu l'étude. PL, RO et DAC ont conçu le dispositif du système d'exposition et réalisé la dosimétrie électromagnétique. AJ, LP, AC, YLC, FPDG, AH, FM, MC et YP ont collecté et assemblé les données. AG a effectué l'analyse statistique des résultats. YP, IL, DAC et PL ont rédigé le manuscrit. Tous les co-auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Yann Percherancier.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Joushomme, A., Orlacchio, R., Patrignoni, L. et al. Effets des expositions aux champs de radiofréquence 3,5 GHz modulés par la 5G sur l'activation de HSF1, RAS, ERK et PML dans les fibroblastes vivants et les cellules kératinocytes. Sci Rep 13, 8305 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35397-w

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Reçu : 27 octobre 2022

Accepté : 17 mai 2023

Publié: 23 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-35397-w

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